A última década anunciou a era espacial da ômica de célula única. Usando novas técnicas, os pesquisadores constroem mapas celulares e moleculares abrangentes, detectando inúmeras transcrições e proteínas em resolução de célula única e em espaço tridimensional. Muitas técnicas espaciais de ômica de célula única concentram-se no perfil de mRNA dentro de um espaço de tecido.1 Enquanto a análise transcriptômica distingue subtipos de células e identifica estados celulares, os pesquisadores devem corroborar esses resultados com análises de proteínas para reconhecer assinaturas moleculares únicas presentes em células individuais. A exploração desses conjuntos de dados proteômicos espaciais permite que os cientistas classifiquem células, identifiquem novos tipos de células e genes, rastreiem linhagens celulares e descubram vias causadoras de doenças.
Os pesquisadores normalmente querem perfilar tantos marcadores de proteína em uma amostra de uma só vez para obter uma imagem melhor da organização e função do tecido. Uma maneira de visualizar a expressão de proteínas em compartimentos subcelulares é com imuno-histoquímica fluorescente (IHC), uma abordagem poderosa para caracterizar fenótipos celulares biologicamente relevantes. A IHC fluorescente tradicional é um método inerentemente de baixo rendimento e trabalhoso; a coloração de alguns marcadores de proteína dentro de seções de tecido pode levar até uma semana.2 O perfilamento de apenas um número limitado de marcadores em cada amostra de cada vez limita a capacidade dos cientistas de capturar a complexidade de um tecido e, portanto, reduz o escopo da descoberta. Além disso, a subsequente aquisição de imagem e análise de dados são processos longos que requerem um técnico especializado para operar um microscópio sofisticado. Portanto, os pesquisadores desenvolveram abordagens de imagem de tecidos multiplexados que processam e analisam simultaneamente vários marcadores em milhares de células.
A imunohistoquímica encontra a automação e a multiplexação
Avanços recentes em tecnologias eletrônicas, ópticas e químicas tornaram a imagem celular multiplexada uma realidade, aumentando a velocidade experimental, escala, resolução e rendimento. CellScapeTM ChipCytometryTM é uma plataforma revolucionária que combina um sistema avançado de imagem óptica com fluídica para aplicações espaciais multiplexadas, permitindo aos cientistas distinguir biomarcadores de proteína ilimitados em uma amostra de tecido e quantificar a expressão desses marcadores com resolução de célula única. Equipado com um manipulador de líquidos automatizado, scanners de slides e um pipeline de imagens para aquisição de imagens 24 horas por dia, ele processa várias amostras sem intervenção constante do usuário.
O fluxo de trabalho automatizado do CellScape envolve três etapas para obter a coloração de tecidos multiplex. Primeiro, a etapa de imunocoloração marca amostras de tecido com até 5 anticorpos marcados com fluorescência de cada vez. Em seguida, a etapa de geração de imagens usa imagens de alta faixa dinâmica (HDR) para adquirir imagens para uma ampla variedade de alvos de baixa e alta expressão com precisão e resolução superiores. Por fim, a etapa de fotobranqueamento remove os sinais de fluorescência, o que permite a imunocoloração da mesma amostra com um novo conjunto de anticorpos.
O recurso de aquisição de imagem HDR torna o CellScape uma plataforma de imagem exclusiva que quantifica com precisão os sinais de baixa e alta intensidade, permitindo aos pesquisadores traçar o perfil de proteínas alvo de baixa e alta expressão simultaneamente. Ao capturar imagens com diferentes tempos de exposição, o sistema detecta uma ampla gama de intensidades de sinal e as combina para criar uma única imagem composta. Além disso, o sistema HDR remove automaticamente a autofluorescência e retém metadados de aquisição de imagem para que o usuário realize análises avançadas. Por fim, a ferramenta de análise de dados CellScape apresenta segmentação automática de células e análise estatística para gerar gráficos de pontos para valores de expressão com facilidade e eficiência.
Comparado a outras plataformas de imagem de tecidos multiplex, o CellScape funciona com reagentes de anticorpos publicados e de código aberto amplamente utilizados, tornando a aplicação econômica e fácil de adaptar e validar em laboratórios individuais. Usando o sistema, os pesquisadores podem padronizar uma ampla gama de anticorpos de diferentes fornecedores, o que torna o instrumento aplicável a uma variedade de campos de pesquisa, incluindo neurociência, oncologia, imunologia e doenças infecciosas.
Fenotipagem Espacial em Tecido FFPE Humano
Os biólogos usam modelos animais para entender anatomia, fisiologia e mecanismos de doenças; no entanto, não há substituto para a percepção incomparável obtida do tecido humano. A maioria das amostras de tecido humano clinicamente relevantes são preservadas como seções embebidas em parafina fixadas em formalina (FFPE). Recentemente, os pesquisadores usaram ChipCytmetry em fatias de tecido FFPE saudáveis e cancerígenos para investigar a infiltração de células imunes em tumores. tipos celulares raros. Com um aumento contínuo no número de anticorpos conjugados com fluorescência comercialmente disponíveis para seções de tecido FFPE, ChipCytometry tem o potencial de revolucionar a pesquisa de diagnóstico clínico.
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Referências
1. L. Waylen et al., “From whole-mount to single-cell space assessment of gene expression in 3D”, Commun Biol, 3:602, 2020.
2. LL Matos et al., “Imunohistoquímica como uma ferramenta importante na detecção de biomarcadores e na prática clínica”, Biomark Insights, 5:9-20, 2010.
3. S. Jarosch et al., “Imagem multiplexada e quantificação automática de sinal em tecidos embebidos em parafina fixados em formalina por ChipCytometry”, Cell Rep Methods, 1(7):100104, 2021.
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